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Samstag, 03 März 2007 19:38 |
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Wochentag |
Datum |
Vormittag |
Nachmittag |
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Donnerstag |
20.02.1997 |
9 Uhr Seminar (Jan Seele), Einführung (Allgemeines, Diatomeen, Lichtmikroskop) ab 11Uhr Seminar (Christian Lederle) |
ab 14:30 Uhr Seminar (Dr. Joachim Hürlimann über Diatomeen in der Kriminalistik und Rechtsmedizin) |
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Freitag |
21.02.1997 |
Einarbeitung in die Bestimmungsliteratur und Gebrauch des Lichtmikroskops, Köhlern |
Umgang mit Karteikasten zum Bestimmen |
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Samstag |
22.02.1997 |
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Sonntag |
23.02.1997 |
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Montag |
24.02.1997 |
Artenbestimmung |
Artenbestimmung |
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Dienstag |
25.02.1997 |
Artenbestimmung |
Artenbestimmung |
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Mittwoch |
26.02.1997 |
Artenbestimmung |
Artenbestimmung |
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Donnerstag |
27.02.1997 |
Artenbestimmung |
Artenbestimmung |
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Freitag |
28.02.1997 |
Einführung in die Trophiebestimmung des Spitzingsees mit Hilfe des Trophie-Indexes von Diatomeen |
Einführung in die Rasterelekronenmikroskopie |
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Samstag |
01.03.1997 |
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Sonntag |
02.03.1997 |
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Montag |
03.03.1997 |
Anfertigen der Tropfpräparate |
Artdokumentation am REM durch Fotos |
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Dienstag |
04.03.1997 |
Artdokumentation am REM durch Fotos |
Artdokumentation am REM durch Fotos |
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Mittwoch |
05.03.1997 |
Artdokumentation am REM durch Fotos |
Artdokumentation am REM durch Fotos |
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Donnerstag |
06.03.1997 |
9Uhr Seminar, Artdokumentation am REM durch Fotos |
Artdokumentation am REM durch Fotos |
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Freitag |
07.03.1997 |
Einführung in das Fotolabor |
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Samstag |
08.03.1997 |
Seminar: Geschichte der Limnologie |
Geschichte der Limnologie |
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Sonntag |
09.03.1997 |
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Montag |
10.03.1997 |
Anfertigen von Papierabzügen |
Anfertigen von Papierabzügen |
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Dienstag |
11.03.1997 |
Anfertigen von Papierabzügen |
Anfertigen von Papierabzügen |
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Mittwoch |
12.03.1997 |
Anfertigen von Papierabzügen |
Anfertigen von Papierabzügen |
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Donnerstag |
13.03.1997 |
Aufräumen und Abschlussbesprechung |
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Cymbella hevetiva bauchige Kahnkieselalge
2. Bacillariophyceae, Diatomeen, Bacillariophyta, Diatomeae,
(engl.: diatoms)
Inhalt
2.1. Allgemeine Beschreibung zur Untersuchung von Kieselalgen
Formenreichste Gruppe einzelliger, auch kolonie- und kettenbildender Algen mit ca. 10000 bekannten
Arten im Stamm der Chrysophyta. Diatomeen spielen ökologisch eine große Rolle, weil sie am Anfang
der Nahrungskette, besonders im Meer, stehen. Manche Arten sind wichtige Bioindikatoren für die
Wasserqualität. Die Süßwasserflora ist weltweit verbreitet, wobei es wenige Endemiten gibt. Diese halten
sich an Meeresküsten, in Salinen und speziell am Neusiedler See auf, weil sie dort auf neue ökologische
Bedingungen treffen. Die oft massenhaft auftretenden Kieselalgen leben auf Steinen, Sand , Boden
sowie in Süß-, Brack - oder Salzwasser und können durch den Wind weiträumig verbreitet werden.
Die Familie der Naviculaceen stellt die umfangreichste Unterordnung dar. Man gliedert die Kieselalgen
in zwei Unterordnungen ein, die rundlichen Centrales und die Pennales mit länglichen Schalen. Da die
morphologischen Merkmale, also die Architektur der Schalen alleine für die Systematik verwendet wird,
gibt es wegen den identischen Formen und Übergangsformen Streit. Ihre Taxonomie dient daher als
objektives Verständigungsmittel, und muss mit dem verbundenen Arbeitsaufwand für eine zuverlässige
Bestimmung im Einklang stehen. Man hat herausgefunden, dass Temperatur, pH-Wert, Salinität sowie
Phosphat- und Silikatgehalt des Mediums für die Form der Schalen eine Rolle spielen.
Man erkennt im Zentrum der Schale die Raphe (=Naht), eine gebogene Längslinie, die nach beiden
Seiten läuft. Mit diesen rinnenförmigen oder kanalförmigen Strukturelementen, bewegen sich die Zellen,
z.B. gleitend auf festem Untergrund, fort.
Alle Ordnungen haben folgende Eigenschaften gemeinsam:
sie leben pelagisch (frei), sessil (Substratkontakt durch Gallertefäden) oder koloniebildend (Gallertefäden,
Filamente).
-sie haben eine Größe von 2,5 Mikrometer bis 2 Millimeter.
-ihre morphologische Gliederung ist bei allen Kieselalgen ähnlich. Man bezeichnet die fast identischen
Schalenhälften (Valven) als obere und untere Valvarebene (zu sehen in der Valvenansicht), die durch die
Pervalvarebene oder dem Gürtelband miteinander in Verbindung stehen (Pleural- oder Gürtelansicht).
In der Schale erkennt man die zentrale Raphe. Die Spitzen werden Apix genannt (Genaueres vgl. 6.
Bestimmung von Diatomeen).
-dicht unter der Zelloberfläche befindet sich die Kieselschale (Frustel). Sie ist auf mannigfache Weise
ornamentiert und von Poren durchbrochen, die die Verbindung zwischen Zellinhalt und Umgebung
herstellen. Die Frustel ist wie eine Schachtel aufgebaut, aus einer Unterschale (Hypotheka) und einer
geringfügig größeren Oberschale (Epitheka). Hauptsubstanz ist die Kieselsäure Si(OH)4
(Orthokieselsäure), die unter Wasserabspaltung in Metakieselsäure H2SiO3 (ketten-, bandförmige oder
dreidimensionale Gebilde) und dann in das Anhydrit SiO2 Siliziumdioxid übergeht. Dieses wird in
SCVs (silica depositing vesicles) unterhalb der künftigen Zelloberfläche im Cytoplasma deponiert und
bildet komplex gebaute Strukturen aus. Diese Poren, Rillen, Stege, Wülste und Auswüchse sind
artspezifisch angeordnet. Die Form des Siliziumoxids ist amorph und ähnelt dem Opal, was der Struktur
hohe Festigkeit gibt.
·
-sie besitzen in ihrer Zellwand Diatotepin, ein saures Polysaccharid.
-der Zellkern liegt zentral, die Chloroplasten sind wandständig (1-2 bei Kieselalgen mit Raphen, ansonsten
mehrere scheibenförmige).
-aus der Raphe wird bei der Bewegung eine Gallerte ausgeschieden, die in der Gallerte entlang gleitet.
Der Prozess ist noch ungeklärt.
·
-als Auftriebsorgane dienen ölgefüllte Vakuolen oder Schwebefortsätze.
-zur Photosynthese in den braunen Chloroplasten haben sie Chlorophyll a und c sowie Carotinoide
(β-Carotin) und Xanthophylle (Fucoxanthin, Violaxanthin). Die Kieselsäure ist nicht nur Baumaterial,
sondern auch für den Stoffwechsel wichtig.
·
-Reservestoffe sind Fette und Chrysolaminarin (=Leukosin), bzw. Laminaran und Mannitol.
-ihr Lebensraum ist vielfältig (marin, limnisch, epiphytisch, epilithisch, epipelisch, epiplanktisch, etc.,
Kieselschalen bedecken etwa 8 % des Meeresbodens, kommen in der in der Antarktis und der Sahara
vor). Er wird hauptsächlich von Feuchtigkeit und Licht bestimmt.
·
-Die Verbreitung wird hauptsächlich von der Atmosphäre (Wind) und dem Menschen (Verkehr) bestimmt.
-die Schalenreste sind fossil (40 000 - 100 000 Arten) und subfossil als Kieselgur und Diatomit
(Diatomeenerde) aus dem Mesozoikum seit Beginn der Kreidezeit (ca. 250 Millionen Jahre) erhalten
und werden im Straßenbau, als Scheuermittel oder als Silicagel mit hohen Adsorptionsvermögen
(HPLC, LC, Chromatografie) in der Forschung verwendet.
Gomphonema acuminatum Spitze Stielchen-Kieselalge
·
-sie ist mitotisch oder sexuell. Bei der Mitose, wird eine Zygote zur Auxospore und teilt sich durch
Oogamie in zwei Auxosporen. Die Teilung erfolgt meist entlang der Raphe. Dabei scheidet jede
Schalenhälfte eine kleinere ab, die in die alte hineinpasst. Die neue Theka ist also stets eine (kleinere)
Hypotheka. Weitere Zellteilungen ergeben immer kleinere Tochterzellen, bis eine Minimalgröße
(30 - 50 % kleiner) erreicht wird. Die sexuelle Fortpflanzung (Meiose) ermöglicht die Rückkehr zur
Originalgröße. Um der Verzwergung zu entgehen, kann eine Teilung übersprungen werden oder das
Gürtelband flexibel bleiben.
-begeißelt sind nur männliche Zellen der Unterordnung Centrales, welche zur sexuellen Fortpflanzung
Ei- und Spermazellen bilden. Bei den Pennales unterscheiden sich normale Zellen nicht von denen,
die eine Reduktionsteilung gemacht haben. Innerhalb einer gemeinsam gebildeten Kopulationsgallerte
werden Gameten ausgetauscht (auch Autogamie, zwei Gameten aus derselben Zelle möglich).
-die Teilungsfrequenz liegt unter 24 Stunden. Bei idealen Bedingungen bedeutet das für eine Zelle
Tausend Nachkommen nach 10 Tagen (20 d = 106, 1 m = 109).
-unter ungünstigen Lebensbedingungen bilden viele Arten Dauerstadien (Zysten, Ruhestadien) mit
verstärkter Wand aus.
Navicula praetenita Schiffchen-Kieselalge
2.8. Ordnungen der Kieselalgen
Man gliedert die Kieselalgen in zwei Ordnungen ein, die rundlichen Centrales (Radiärsymmetrie) und
die Pennales mit länglichen Schalen (vgl. Tabelle 2)
Tab. 2: Unterordnungen der Pennales
|
Pennales (Unterordnungen) |
Centrales |
|
Biraphidinae (Raphe auf beiden Seiten) Monoraphidinae (Raphe auf einer Valve) Raphidioidinae (Raphe rudimentär, z.B.nur an Apix) Araphidinae (Raphe fehlt) |
wurden hier nicht weiter unterschieden |
Amphipleura pellucida Glas-Kieselalge
Das Auflösungsvermögen ist der kleinste Abstand (d) zweier Objektpunkte, die getrennt voneinander
abgebildet werden. Diatomeen wurden schon in der Frühzeit der Mikroskopie wegen ihren Feinstrukturen
als Testmodell für das Auflösungsvermögen eines Mikroskops verwendet.
Je kürzer die Wellenlänge des Lichts (vgl. Lasermikroskopie), desto eher trennen sich zwei benachbarte
Bildpunkte. Mit einer Größe von 2,5 Mikrometern sind Diatomeen ohne Hilfsmittel nicht zu erkennen. Um
Objekte, die unterhalb des Auflösungsvermögens des menschlichen Auges liegen wahrzunehmen,
benötigt man ein Vergrößerungsglas (Lupe) oder hintereinander geschaltete Linsensysteme, um noch
stärker zu vergrößern (Mikroskop). Dabei muss die optische Achse der Linsen exakt eingehalten werden.
3.2.Vergleich von Licht- und Rasterelektronenmikroskop
Tabelle 3: Vergleich des Lichtmikroskops mit dem Rasterelektronenmikroskop
|
Lichtmikroskop |
Rasterelektronenmikroskop |
|
Durchstrahlung durchsichtiger Schichten mit Auflicht möglich |
nur Oberflächenbetrachtung (Topografie/Material) möglich |
|
geringe Tiefenschärfe |
hohe Tiefenschärfe |
|
Gesamtbetrachtung |
punktweise Abrasterung |
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Schrägsicht praktisch unmöglich |
Schrägsicht problemlos möglich |
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Untersuchung in Laborluft oder Immersionsöl |
Untersuchung nur im Vakuum möglich (keine lebenden Exemplare) |
|
Wellenlänge l: 397blau-687rotnm |
l= h·(m·v)-1= 1,22·UB^-1/2 [nm] z.B.: für 25 kV als UB => 0,077å |
|
Auflösung 0,35µm, mit Öl 0,2µm |
theoretisch unbegrenzt (s.o.) praktisch max. 10å |
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Vorteile: einfache Handhabung, Auflichtbetrachtung |
Vorteile: hohe Auflösung und Tiefenschärfe, Schräg-sichtmöglichkeit |
|
Nachteile: geringe Auflösung und Tiefenschärfe, keine Schrägsicht |
Nachteile: aufwendige Präparationsmethoden, nur Oberflächenbetrachtung, Vakuum |
Um die Auflösung bei sichtbarem Licht zu erhöhen, kann man entweder den Brechungsindex zwischen
Deckglas und Objektiv erhöhen, indem man die Luft durch Immersionsöl (Brechungsindex n =1 ,25)
ersetzt oder eine kürzere Wellenlänge wählt. Im sichtbaren Licht (l = 400 - 700 nm) sind die Grenzen
der Auflösung des Mikroskops bei 0,35 µm erreicht. Strukturen werden sichtbar, wenn das Licht stark
und weniger stark in der Amplitude abgeschwächt wird und dadurch Kontraste entstehen
(Amplitudenpräparat). Da die Kieselschalen mehr oder weniger durchsichtig sind, kann man sie im
Hellfeld nicht erkennen. Kontraststeigernde Farbstoffe verbessern nicht die Helligkeitsunterschiede.
Das Licht wird je nach der Konsistenz der Diatomeenschale in seiner Phasenlage verändert, passiert
also mit veränderter Geschwindigkeit das Objekt. Seit der Erfindung des Phasenkontrastmikroskops
durch F. Zernike (1935), ist es möglich unter dem Mikroskop kontrastarme Strukturen sichtbar zu machen.
Man benötigt einen Spezialkondensor mit einer Ringblende und einen "Phasenring", der zwischen
Objektiv und Okular angebracht ist. Zweck dieser Zusatzapperatur ist es, die Lichtwellen des Präparats
um den gleichen Betrag (lamda / 4) in der Phase zu verschieben. Insgesamt beträgt dann die
Verschiebung lamda/2. Durch die Interferenz zwischen gebeugtem und nicht gebeugtem Lichtstrahl,
fällt Wellenberg auf Wellental und es kommt zur Auslöschung. Lichtstrahlen werden abgeschwächt und
somit kontrastierter. Der Hintergrund ist ähnlich wie bei einem fotografischen Negativ dunkel. Bei
größerer Dicke des Präparats erscheinen helle Höfe ("Halo-Effekt") um die Strukturen herum. Bevor
man die Phasenkontrastscheibe in dem Strahlengang bringt, muß man das Mikroskop im Hellfeld
„Köhlern“, also auf das Präparat scharf stellen:
Methodik des „Köhlerns“ eines Lichtmikroskops:
1. Leuchtfeldblende zu
2. Kondensor zu
3. Leuchtfeldblendenrand scharf stellen
4. Kondensorschraube benutzen bis farbige Halos am Rand entfernt sind
5. Kondensor zentrieren
6. Leuchtfeldblende auf
7. Kondensor auf
8. Phasenkontrastscheibe einschieben
Im Rahmen dieses Praktikums wurde zudem eine Videokamera (CCD Sony) mit Restlichtverstärker
und Monitor verwendet, wodurch die Zusammenarbeit zwischen Praktikanten und Praktikumsleiter
erleichtert wurde.
Cymbella cf. affinis Kahn-Kieselalge
Seit 1924 M. de Broglie den Wellencharakter von Elektronenstrahlen erkannte, konnte an der Entwicklung
leistungsfähigerer Mikroskope gearbeitet werden. Dies führte zur Technologie des Elektronen- und
Rasterelektronenmikroskops (REM) (engl.: SEM = scanning electron microscope). Hierbei tastet ein sehr
feiner Elektronenstrahl (Elektronensonde) das Objekt ab.
Das Gerät ist mit einer Bildröhre gekoppelt, auf der ein plastisches Bild der Oberfläche wiedergegeben
wird. Mit Spannungen von 1000 kV wird eine Vergrößerung von 20 000fach und 50 000fach erreicht.
Das Verfahren stellt nur leitende Oberflächen dar, deshalb müssen biologische Objekte durch eine
aufgedampfte Metallschicht (z.B. Gold) leitend gemacht werden. Der monochromatische (primäre)
Elektronenstrahl tritt aus einer Glühwendel, dem Filament aus, das als Elektronenquelle dient. Dann
fokussiert eine Anode je nach Beschleunigungsspannung die austretenden Elektronen. Dieser
Crossoverpunkt ist die virtuelle Quelle der Elektronen, weil hier der engste Strahlenquerschnitt liegt.
Durch mehrere elektrostatische oder magnetische Linsen wird der erzeugte Elektronenstrahl mehrmals
fokussiert. Über eine Ablenkeinheit wird ein elektrisches Feld angelegt, welches die Zeilenabtastung
ermöglicht. Dabei werden die Elektronen parabelförmig abgelenkt und ihre Geschwindigkeit erhöht. Der
dann nochmals gebündelte Elektronenstrahl trifft auf die Oberfläche der Probe. Abhängig von der
Beschleunigungsspannung und der Ordnungszahl (Au 79, Si 14) werden in bestimmten Probentiefen
unterschiedliche Strahlungen freigesetzt. Je höher die Spannung und je niedriger die Ordnungszahl,
desto größer ist die Eindringtiefe. Augerelektronen (2 nm), Rückstreuelektonen (100 nm),
Röntgenstrahlung (500 nm) und Sekundärelektronen (bis 50 nm Probentiefe). Die langsamen
Sekundärelektronen (E < 50 eV) eignen sich am besten, weil sie am häufigsten vorkommen und
beim Abtasten zur besten Auflösung beitragen. Die Intensität des Sekundärstrahls ist vom
Neigungswinkel der Objektoberfläche abhängig. Ein schräg über der Probe angebrachter Detektor
fängt das Signal auf. Die Signale werden verstärkt und als Impulse im Oszilloskop wiedergegeben,
oder sie belichten einen fotografischen Film. Dadurch ist die zeilenweise Abbildung der Topographie
des Präparats in den verschiedenen Graustufen auf dem Bildschirm (Videomonitor) oder als Lichtbild
möglich. Das Signal-Rauschverhältnis sowie die Auflösung und Tiefenschärfe werden durch Faktoren
wie die Beschleunigungsspannung, dem Grad der Öffnung der Aperturblende und der Kondensorlinse
bestimmt. Weiterhin spielt der Arbeitsabstand zur Probe, deren Kippung und die Stellung des Filaments
eine Rolle. Diese Faktoren werden in Tabelle 4 zusammengefasst:
Tabelle 4: über Faktoren die das Signal-Rauschverhältnis sowie die Auflösung und Tiefenschärfe am
Rasterelektronenmikroskop beeinflussen
|
Faktor |
Signal-Rauschverhältnis |
Auflösung und Tiefenschärfe |
|
Beschleunigungsspannung |
||
|
größer |
besser |
besser |
|
kleiner |
schlechter |
schlechter |
|
Aperturblende |
||
|
zu |
schlechter |
besser |
|
auf |
besser |
schlechter |
|
Kondensorlinse |
||
|
nach rechts (=nach oben) |
schlechter |
besser |
|
nach links (= nach unten) |
besser |
schlechter |
|
Arbeitsabstand |
||
|
kleiner |
ohne Einfluss |
besser |
|
größer |
ohne Einfluss |
schlechter |
|
Kippung |
||
|
stärker |
besser bei flachen Proben |
ohne Einfluss |
|
|
ohne Einfluss bei „Gebirgen“ |
ohne Einfluss |
|
schwächer |
schlechter bei flachen Proben |
ohne Einfluss |
|
|
ohne Einfluss bei „Gebirgen“ |
ohne Einfluss |
|
Filament |
||
|
nach rechts |
besser |
geringfügig schlechter |
|
nach links |
schlechter |
geringfügig besser |
Zudem hat die Scangeschwindigkeit und die Probenart (-e -Ausbeute) also auch die Präparation
Einfluss auf das Ergebnis. Als störend wirken sich mechanische Schwingungen (z.B.: eines in der
Nähe vorbeifahrenden LKWs) aus. Weiterhin sollte darauf geachtet werden, dass die leitende Schicht
(Au - Bedampfung) guten Kontakt zum Probenteller hat, damit es zu keiner lokalen Aufladung kommt.
Es sollten alle Kontaminationen des Vakuums vermieden werden (Handschuhe tragen), weil sich
ansonsten Schmutzschichten auf dem Präparat bilden.
Zur Bedienung des REM gehört auch das Hochvakuum, das in der Probenkammer hergestellt wird.
Die Apparatur und die Kühlleitungen müssen über den gesamten Untersuchungszeitraum auch über
Nacht laufen. Drehkolben und Sperrschieberpumpen verdrängen die Luft im Feinvakuum (0,1 Pa) und
verdichtende Pumpen wie (Öldiffusionspumpen, Turbomolekularpumpen) reißen Gasteilchen mit und
erzeugen in der Probenkammer ein Hochvakuum (10-5 Pa). Die Vakuumtechnik ist technisch aufwendig
und teuer.
Gomphonema lateripunctatum Stielchen-Kieselalge, Gürtelbandansicht
4. Herstellen von Diatomeenpräparaten für die Licht- und die
Rasterelektronenmikroskopie
Inhalt
Die Probeentnahme fand am 19.8.1996 an der Probestelle 6 am Spitzingsee statt und wurde von
Jan Seele im Rahmen seiner Doktorarbeit genommen. Mit einem speziellen Bodengrabgerät
(ground digger) wurde eine Probe vom Seegrund geholt.
Tabelle 5: Geräte und Chemikalien der Probenpräparation
|
Geräte |
Chemikalien |
|
Heizplatte bis mindestens 140°C |
H2O bidest |
|
Sputter Coater (Bedampfungsgerät) |
30 %iges H2O2 |
|
Tischzentrifuge (2000 U/min) |
HCl konz. |
|
4 Zentrifugengläser (V = 50 ml) |
K2Cr2O7 |
|
Bechergläser (V = 250 ml) |
Naphrax-Toluol-Gemisch |
|
kleine Schraubdeckelgläser |
|
|
kleiner Spatel |
|
|
Flachpinzette |
|
|
Objektträger |
|
|
Deckgläschen |
|
|
Aluminiumteller |
|
|
Kohlenstoffplättchen doppelseitig klebend |
|
|
Eppendorfpipetten und -caps |
|
|
Pasteurpipette mit Saugball |
|
Die Probe wurde, nachdem sie ins Labor überführt wurde, wie folgt mit dem Material aus Tabelle 5
aufbereitet:
4.2.1. Probe (kann auch mit Formol fixiert sein) wird mit Wasserstoffperoxid V(H2O2) = 50 ml in hohen
Bechergläsern V = 250 ml angesetzt (Schutzbrille). Die Probe bleibt eine Nacht lang im Abzug stehen,
wobei sie dort auch länger bleiben kann.
4.2.2. Am nächsten Tag werden die Proben gekocht. Im Abzug wird auf der Heizplatte 30 min bei 80 °C,
dann 4 h bei 100 °C erhitzt. Es muss darauf geachtet werden, dass die verdunstende Flüssigkeit durch
H2O2 ersetzt wird. Während des Kochens Probe schwenken. Wenn Flüssigkeit vollständig verdampft ist,
dann Glas vor Zugabe von H2O2 abkühlen lassen.
4.2.3. Nach dem Kochen erscheinen Proben, die nicht aus dem Sediment genommen wurden, klar.
4.2.4. Zur vollständigen Oxidation wird eine Spatelspitze Kaliumdichromat in kleinen Portionen zugegeben.
Hierbei Schutzbrille, Latexhandschuhe und Kittel tragen, da es zu einer heftigen Reaktion kommen kann.
Das anfänglich tief violette K2Cr2O7 ändert seine Farbe in Gelborange.
4.2.5. Wenn die Farbreaktion erfolgt ist, dann Probe abkühlen lassen und mit wenigen Tropfen H2O
bidest befeuchten.
4.2.6. Zugabe von 10 Tropfen HCl, wobei ein Farbumschlag zu Blau erfolgen kann. Nochmals für wenige
Minuten bei 100°C kochen, und abkühlen lassen.
4.2.7. Proben werden in Zentrifugengläser gefüllt und bei 2000 Umdrehungen pro Minute 15 Minuten
lang zentrifugiert. Dann wird der Überstand vorsichtig abgegossen oder mit der Wasserstrahlpumpe
abgesaugt. Die Diatomeenschalen sind als Bodensatz zu erkennen und werden nach Zugabe von H2O
bidest nochmals wie oben zentrifugiert. Diesen Waschvorgang zweimal wiederholen. Die Probe nach
dem letzten Zentrifugieren und nach Abschütten des Überstands in ein kleines Schraubdeckelglas
überführen. In diesem Zustand ist die Probe im Kühlschrank für mehrere Monate lagerungsfähig.
4.3. Präparatherstellung für das Lichtmikroskop
4.3.1. Runde Deckgläschen (Ød = 1 cm) werden 5-10 min lang auf der Heizplatte ausgeglüht und dann
wieder abgekühlt.
4.3.2. Dann werden verschiedene Verdünnungen hergestellt. Dazu werden Eppendorfcaps mit
Eppendorfpipetten verwendet, um drei verschiedene Verdünnungen herzustellen. Schraubdeckelglas
gut schütteln.
100 µl Stammlösung + 900 µl H2Obidest
= 1:10 Verdünnung
50 µl Stammlösung + 50 µl 1:10 Verdünnung = 1:20 Verdünnung
25 µl Stammlösung + 50 µl 1:10 Verdünnung = 1:30 Verdünnung
Verdünnungen gut mischen und 50 µl auf die ausgeglühte Seite des angewärmten Deckglases
auftragen. Die Deckgläschen müssen möglichst eben und erschütterungsfrei gelagert werden.
Die Probenflüssigkeit trocknet bei Raumtemperatur ein. Zum Zählen und Bestimmen der
Diatomeenschalen braucht man eine optimale Verdünnung auf dem Deckgläschen.
4.3.3. Für die Einbettung der Probe in Harz werden beschriftete Objektträger bei 140 °C auf der
Heizplatte erhitzt.
4.3.4. Mit einer Pasteurpipette werden 2-3 Tropfen eines Naphrax-Toluol-Gemisches auf jeden
der 140 °C heißen Objektträger aufgetragen. Das Toluol verdampft und das Naphrax bleibt flüssig
zurück. Hierbei unter dem Abzug arbeiten, da Toluol giftig ist. Die Deckgläschen werden mit der
Probenseite nach unten in das Naphraxharz eingebettet. Innerhalb 5 Minuten das Toluol
verdampfen lassen.
4.3.5. Das Harz wird beim Erkalten zäh und härtet aus. Damit alle Diatomeenschalen in einer
Ebene liegen, mehrmals vor Abschalten der Heizplatte vorsichtig mit einer Pinzette auf die
Deckgläschen drücken. Man erhält dadurch eine dünne Schicht zwischen Deckgläschen und
Objektträger.
4.3.6. Die Objektträger bleiben zum langsamen Abkühlen auf der Heizplatte liegen.
Denticula tenuis Zähnchen-Kieselalge
4.4. Präparatherstellung für das Rasterelektronenmikroskop
Die aufbereiteten Proben werden verdünnt. Aus einer 1:20 (1 Teil Probe, 4 Teile H2O bidest)
verdünnten Probeflüssigkeit werden zwei Verdünnungen (1:400, 1:800) hergestellt:
Tabelle 6: Verdünnung der REM-Proben
|
Probenummer: |
82 |
110 |
||
|
REMProbenummer: |
481 |
482 |
483 |
484 |
|
Verdünnung: |
1:400 |
1:800 |
1:400 |
1:800 |
|
V (Stammlösung) |
50µl |
25µl |
50µl |
25µl |
|
V (H2Obidest) |
1000µl |
1000µl |
1000µl |
1000µl |
4.4.2. Vorbereiten der Probenteller
Ausgeglühte Deckgläschen werden mit beidseitig klebenden Kohlenstoffplättchen auf spezielle
Probenteller (aus Aluminium) geklebt. Latexhandschuhe tragen und mit Pinzette arbeiten, um eine
Kontamination zu vermeiden. Mit einer Pasteurpipette werden die verdünnten Lösungen auf die
Deckgläschen aufgetropft. Dabei muß der Tropfen möglichst erschütterungsfrei und eben eintrocknen.
Das Verdunsten des Wassers dauert einige Stunden. Dann klebt man mit Hilfe einer Pinzette die
Deckgläschen mit der Probenseite nach oben auf die beschrifteten Aluminiumteller. Will man feste
Proben untersuchen, so werden diese direkt auf das Kohlenstoffplättchen geklebt.
Die Proben werden in den Sputter Coater (Bedampfungsgerät) gestellt. Dieser besteht aus einem
Zylinder, in dem in einer Edelgasatmosphäre (Ar) ein Plasmastrahl erzeugt wird, der aus einer Goldfolie
einzelne Goldatome verdampft (Vdp.: 3130 K, EVerdampfung = 324,43 kJ/mol).
Dazu bestückt man den Zylinder mit den Aluprobetellern.
Danach muss die Laborluft durch ein Vakuum (über 10 Pa) entfernt werden.
Hierfür müssen die Leak und Vent- Schrauben geschlossen sein.
Dann lässt man Argon einströmen, bis 10 Pa erreicht sind.
Die Leakschraube wird langsam bis ca. 20-25 mA aufgedreht.
Der Timer wird auf 105 s gestellt und die Starttaste gedrückt.
Mit der Ventschraube oder der Deckelschraube Zylinder nach 2min belüften und bedampfte Proben
entnehmen. Beim Bedampfen der Proben sollte beachtet werden, dass zu lange Bedampfungszeiten
eine zu dicke Goldatomschicht erzeugen, die die Feinstruktur der Diatomeen verdecken kann. Die
kunstvoll, vollendet ausgearbeitete Oberflächenstruktur ist somit im REM nicht sichtbar.
Brachysira neoexilis Schiffchen-Kieselalge
5. Kieselalgen als Indikatororganismen zur Bestimmung der
Gewässerverschmutzung
Inhalt
5.1. Qualitative und quantitative Auswertung eines Diatommeenpräparats aus dem Spitzingsee
Voraussetzung für ein gutes Präparat ist eine ausreichende Individuenzahl, wobei die Diatomeenschalen
nicht übereinander liegen sollten. Der Objektträger wird systematisch von links oben nach rechts unten
betrachtet. Mit Hilfe eines Zählgitters, das gleichzeitig als Maßstab (Kantenlänge l = 10 µm) dient, werden
die Diatomeenschalen bestimmt und in einer Artenliste gezählt. Es wurden mehr als 400 Individuen
gezählt, um eine repräsentative Übersicht über die Artenverteilung zu haben.
Diatomeen sind gute Bioindikatoren, weil sie kosmopolitisch in Gewässern aller Art vorkommen, und
eine schnelle Generationsfolge haben. Die relative Arthäufigkeit und das Artenspektrum ist direkt mit den
Veränderungen eines Milieus korreliert. Durch die Erforschung der ökologischen Ansprüche konnte ein
quali- und quantitatives Indikatorsystem für die Gewässerbelastung entwickelt werden. Aus der relativen
Häufigkeit lässt sich so die Abundanz der Arten bestimmen. Mit der Gewichtung (nach Verbreitung der
Arten in unterschiedlichen Trophiegraden) und der trophischen Lokation (berechnet aus signifikanten
Korrelationen von Artenvorkommen und Gesamtphosphat) lässt sich der Trophieindex also die Trophie
des Spitzingsees berechnen. Will man zusätzlich noch etwas über die Saprobie (organische Belastung)
wissen, dann eignen sich Kieselalgen mit ihren Leitorganismen als Anzeiger der „mittleren“
Gewässerstufe (2, 2 - 3,3).
|
"Perhaps A. minutissima is the species which has the widest `window`of tolerance, e.g. of pH.... It is over a wide area of the earth`s surface and it also has highly intensity prevalent i.e. high cell density where it occurs)." (ROUND1990) |
Tabelle 7: Daten des Objektträgers (OT82)
|
Objektträgernummer: |
82 |
|
Leitfähigkeit: |
300 µS/cm => "moderat", entspricht mittlerem Elektrolytgehalt |
|
Verdünnung : |
1:20 |
|
Probestelle: |
6 |
|
Datum der Probeentnahme: |
19.08.1996 |
|
Auszähldatum: |
21.02.1997 |
|
gezählt von: |
Joern Kimpel im Rahmen des GPII der Limnologie in Iffeldorf/Oberbayern |
|
Mikroskop: |
Laborlux, K, Fa.Leitz |
|
Zelldichte: |
9,067 Individuen/mm² |
|
Artenzahl/Zahl der Taxa: |
15 |
|
Summe der bestimmten Schalenhälften: |
418 |
Gomphonema acuminatum Spitze Stielchen-Kieselalge
5.2.1. Bestimmung der Gewässertrophie anhand des Diatomeenindex
Tabelle 8: gefundene Arten / Taxa und ihrer statistischer Zuordnung
|
Artname / Taxa |
Anzahl |
Abundanz (%) |
Frequenz |
relative Häufigkeit |
Toleranzgruppen |
trophische Lokation |
Gewichtung |
saprobielle Valenz |
||
|
Achnanthes exigua |
1 |
0,239 |
1 |
1 |
am-eut |
4 |
2 |
ams |
||
|
Achnanthes lanceolata |
1 |
0,239 |
1 |
1 |
tol |
- |
- |
ams |
||
|
Achnanthes minutissima var. minutissima |
369 |
88,277 |
5 |
5 |
tol |
- |
- |
bams |
||
|
Achnanthes minutissima var. gracillima |
7 |
1,675 |
2 |
3 |
ot |
1 |
3 |
os |
||
|
Achnanthes trinodis |
1 |
0,239 |
1 |
1 |
ot |
1,3 |
3 |
os |
||
|
Cocconeis placentula |
3 |
0,719 |
1 |
2 |
tol |
- |
- |
bms |
||
|
Cymbella cf. hybrida |
1 |
0,239 |
1 |
1 |
ot |
1,1 |
3 |
os |
||
|
Cymbella silesiaca |
3 |
0,719 |
1 |
2 |
tol |
- |
- |
ams |
||
|
Denticula tenuis |
20 |
4,785 |
2 |
3 |
ol-amt |
3 |
1 |
ams |
||
|
Eunotia arcus |
1 |
0,239 |
1 |
1 |
ol-bmt |
1,5 |
2 |
os |
||
|
Fragilaria pinnata |
2 |
0,478 |
1 |
2 |
tol |
- |
- |
bms |
||
|
Fragilaria tenera |
2 |
0,478 |
1 |
2 |
ol-amt |
2,5 |
1 |
os |
||
|
Gomphonema lateripunctatum |
6 |
1,435 |
2 |
3 |
ol-bmt |
1,8 |
2 |
os |
||
|
Meridion circulare |
1 |
0,239 |
1 |
1 |
am-eut |
4 |
2 |
bms |
||
|
|
|
Summe ∑= 100 |
|
|
|
|
|
|
||
|
Centrales |
24 |
Centrales spielen bei dieser Auswertung keine Rolle mehr. Das gilt ebenfalls für die gezählten 46 Gürtelbänder (36 x Achnanthes, 4 x Fragilaria und 6 x Gomphonema). |
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5.2.1.1. Trophie-Index (nach PANTLE & BUCK 1955)
Tabelle 9: Trophie-Index
|
1,00-1,99 |
oligotroph |
|
2,00-2,49 |
oligo- mesotroph |
|
2,50-3,49 |
mesotroph |
|
3,50-3,99 |
meso- eutroph |
|
4,00-5,00 |
eutroph |
5.2.1.2. Formel zur Berechnung des Trophieindex (TI)
Formel 1: Trophieindex (TI)
∑(Abundanz) · ∑(Gewichtung) · ∑(trophische Lokation)
TI= ------------------------------------------------------------------------
∑(Abundanz) · ∑(Gewichtung)
5.2.1.3. Tabelle des Trophieindex (TI)
Der Trophieindex wurde aus signifikanten Korrelationen von Artenvorkommen und Gesamtphosphat
in bayerischen Alpenrandseen berechnet. Je größer der Wert der trophischen Lokation ist, desto
trophietoleranter ist eine Art.
Tabelle 10: Trophieindex (TI)
|
Artname / Taxa |
Abundanz |
Gewichtung |
trophische Lokation |
Zähler |
Nenner |
Toleranzgruppen |
saprobielle Valenz |
Wassergüteklasse |
|
|
Achnanthes exigua |
0,00239 |
2 |
4 |
0,0191 |
0,0048 |
am-eut |
ams |
III-IV |
|
|
Achnanthes lanceolata |
0,00239 |
- |
- |
0,0000 |
0,0000 |
tol |
ams |
III-IV |
|
|
Achnanthes minutissima var. minutissima |
0,88277 |
- |
- |
0,0000 |
0,0000 |
tol |
bams |
III |
|
|
Achnanthes minutissima var. gracillima |
0,01675 |
3 |
1 |
0,0503 |
0,0503 |
ot |
os |
I-II |
|
|
Achnanthes trinodis |
0,00239 |
3 |
1,3 |
0,0093 |
0,0072 |
ot |
os |
I-II |
|
|
Cocconeis placentula |
0,00719 |
|
|
0,0000 |
0,0000 |
tol |
bms |
II-III |
|
|
Cymbella cf. hybrida |
0,00239 |
3 |
1,1 |
0,0079 |
0,0072 |
ot |
os |
I-II |
|
|
Cymbella silesiaca |
0,00719 |
- |
- |
0,0000 |
0,0000 |
tol |
ams |
III-IV |
|
|
Denticula tenuis |
0,04785 |
1 |
3 |
0,1436 |
0,0479 |
ol-amt |
ams |
III-IV |
|
|
Eunotia arcus |
0,00239 |
2 |
1,5 |
0,0072 |
0,0048 |
ol-bmt |
os |
I-II |
|
|
Fragilaria pinnata |
0,00478 |
- |
- |
0,0000 |
0,0000 |
tol |
bms |
II-III |
|
|
Fragilaria tenera |
0,00478 |
1 |
2,5 |
0,0120 |
0,0048 |
ol-amt |
os |
I-II |
|
|
Gomphonema lateripunctatum |
0,00435 |
2 |
1,8 |
0,0157 |
0,0087 |
ol-bmt |
os |
I-II |
|
|
Meridion circulare |
0,00239 |
2 |
4 |
0,0191 |
0,0048 |
am-eut |
bms |
II-III |
|
|
|
Summe ∑= 1 |
|
|
Summe ∑=0,284028 |
Summe ∑=0,14026 |
|
|||
TI= 0,284028: 0,14026 = 2,03
5.2.1.4. Teilergebnis
Der Trophieindex deckt sich weitgehend mit den Aussagen der Toleranzgruppe und der
saprobiellen Valenz, weshalb ersichtlich ist, dass sich der Spitzingsee zu dieser Zeit im
oligotrophen bis b-mesotrophen Bereich (TI = 2,065 +/- 0,33) der Nährstoffversorgung
(Gesamtphosphat) befindet. Gemittelt hat das Wasser dieser Probe die Wassergüteklasse II-III
(2,357 +/- 0,143).
5.2.2. Diversitäts-Index (nach SHANNON & WEAVER)
Beispiel: Nur 1 Art mit 100 % => H = 0 Diversität als Maß der Vielfalt einer Biozönose.
5.2.2.1. Formel zur Berechnung des Diversitätsindex (H)
Formel 2: Diversitätsindex (H)
H= -∑ (Abundanz) · ln (Abundanz); wobei für H gilt: 0 =< H < 6
5.2.2.2. Tabelle des Diversitätsindex (H)
Tabelle 11: Diversitätsindex (H)
|
Artname / Taxa |
(Abundanz) |
ln(Abundanz) |
Produkt·(-1) |
Diversitäts-Index: H |
|
Achnanthes exigua |
0,00239 |
-6,036461913 |
0,0144271 |
0,556283373 |
|
Achnanthes lanceolata |
0,00239 |
-6,036461913 |
0,0144271 |
|
|
Achnanthes minutissima minut. |
0,88277 |
-0,124690588 |
0,1100731 |
|
|
Achnanthes min.var.gracillima |
0,01675 |
-4,089357021 |
0,0684967 |
|
|
Achnanthes trinodis |
0,00239 |
-6,036461913 |
0,0144271 |
|
|
Cocconeis placentula |
0,00719 |
-4,935064107 |
0,0354831 |
|
|
Cymbella cf. hybrida |
0,00239 |
-6,036461913 |
0,0144271 |
|
|
Cymbella silesiaca |
0,00719 |
-4,935064107 |
0,0354831 |
|
|
Denticula tenuis |
0,04785 |
-3,039684161 |
0,1454489 |
|
|
Eunotia arcus |
0,00239 |
-6,036461913 |
0,0144271 |
|
|
Fragilaria pinnata |
0,00478 |
-5,343314732 |
0,025541 |
|
|
Fragilaria tenera |
0,00478 |
-5,343314732 |
0,025541 |
|
|
Gomphonema lateripunctatum |
0,00435 |
-5,437579434 |
0,0236535 |
|
|
Meridion circulare |
0,00239 |
-6,036461913 |
0,0144271 |
|
|
|
∑=1 |
|
∑=0,556283373 |
|
5.2.2.3. Teilergebnis:
Die hohe Abundanz von Achnanthes minutissima var. minutissima senkt die Diversität
und damit die Vielfalt der Taxagesellschaft gegen Null (H = 0,556).
5.2.3. Evenness (nach LOZAN 1992)
Beschreibt das Verhältnis der Arten zueinander, wodurch die Dominanzstruktur ersichtlich wird.
5.2.3.1. Formel zur Berechnung der Evenness (E)
Formel 3: Evenness (E)
E= H = 0,205418412
ln (Artenzahl)
5.2.3.2. Teilergebnis:
Die Evenness beträgt 20,542%, jedes fünfte gefundene Taxa ist hinsichtlich seiner Abundanz verschieden.
Tabellaria flocculosa Moor-Kieselalge, Gürtelbandansicht
Es konnte eine Beziehung zwischen der Toleranzgruppe und dem saprobiellen Index gefunden werden.
Die Diversität ist gering, die Dominanz von Achnanthes minutissima var. minutissima sehr hoch.
Der Spitzingsee weist an diesem Tag bei den Kieselalgen eine Evenness von E = 20,54 % und eine
Diversität von H = 0,55 auf.
Sein Seewasser liegt im oligotrophen bis b-mesotrophen Bereich (TI = 2,065+/-0,33).
Dennoch handelt es sich um ein Einzelergebnis und muß durch weitere Erhebungen, beispielsweise
faunistischer Art, gefestigt werden.
Betrachtet man die Abundanz der Arten, dann fällt Achnanthes minutissima var. minutissima (mit 88 %)
auf. Um dennoch eine Artverteilung ersichtlich zu machen, ist diese Art in Diagramm 1 nicht vollständig
darstellbar (369 Schalenhälften). Reduziert man jedoch die Skala des Diagramms auf 25, dann sind die
anderen Taxa zu sehen. Da Achnanthes minutissima var. minutissima eine trophietolerant ist, spielt
dieses Taxa in der weiteren Diskussion keine Rolle mehr. Beim Vergleich fällt auf, dass die indizierten
Arten tatsächlich in der Toleranzgruppe der trophischen Lokation liegen, der Trophieindex demnach
prinzipiell als Verfahren zur Bestimmung der Trophie eines Gewässers sinnvoll ist.
Was die Saprobie angeht, dann stimmt die saprobielle Valenz mit der ansteigenden trophischen Lokation
überein. Diese Ergebnisse können selbstverständlich mit wasserchemischen Analysen bestätigt werden.
Aus den Diagrammen wird beim Vergleich der Arten, die nicht zu den Toleranten zählen, sondern eher
differenzierend sind, die Möglichkeit eines Indexes aus Diatomeen zur Bestimmung der Gewässergüte
bestätigt.
Diagramm 1: Auffällig ist die Dominanz von Achnanthes minutissima var. minutissima
Um die weniger dominanten Arten dennoch auszuwerten, werden trophietolerante Arten und Arten ohne
Trophieindex weggelassen. Es bleiben noch neun Arten für eine Bewertung übrig.
Diagramm 2: Am häufigsten kommen nach Ausschluß von Achnanthes minutissima var.
minutissima, Denticula tenuis, Achnanthes minutissima var. gracillima und Gomphonema
lateripunktatum vor. Gleiches gilt für die gefunde Frequenz
Tabellarischer Vergleich zwischen gefundenen Trophie- und Saprobiedaten:
Tabelle 12: Zusammenfassung über Trophie und Saprobie der neun Arten.
|
Artname/Taxa |
Toleranzgruppe der Trophie |
trophische Lokation |
saprobielle Valenz |
Wassergüteklasse |
|
Achnanthes min.var.gracillima |
ot |
1 |
os |
I-II |
|
Cymbella cf. hybrida |
ot |
1,1 |
os |
I-II |
|
Achnanthes trinodis |
ot |
1,3 |
os |
I-II |
|
Eunotia arcus |
ol-bmt |
1,5 |
os |
I-II |
|
Gomphonema lateripunctatum |
ol-bmt |
1,8 |
os |
I-II |
|
Fragilaria tenera |
ol-amt |
2,5 |
os |
I-II |
|
Denticula tenuis |
ol-amt |
3 |
ams |
III-IV |
|
Achnanthes exigua |
am-eut |
4 |
ams |
III-IV |
|
Meridion circulare |
am-eut |
4 |
bms |
II-III |
